Ein Schwerpunkt unserer Forschungsarbeiten ist bereits seit vielen Jahren die Aufdeckung neuer Krankheitsgene für die seltenen, nach den Mendel’schen Regeln vererbten Krankheiten. Die Anwendung der neuen Hochdurchsatzsequenziertechnologien (next-generation sequencing), zu denen die Exom-, Genom- und Transkriptom-Sequenzierung gehören, hat zu schnellen Fortschritten und einem enormen Erkenntnisgewinn in diesem Teilgebiet der Humangenetik geführt. Wir wenden diese Techniken an, um bei Patient:innen mit einer genetisch bedingten Erkrankung die ursächliche Veränderung zu finden. Das Spektrum an Erkrankungen, das wir bearbeiten, reicht von Entwicklungsstörung und Intelligenzminderung bis zu komplexen Fehlbildungssyndromen, wobei wir ein besonderes Forschungsinteresse am Zimmermann-Laband-Syndrom, den RASopathien (neuro-kardio-fazio-kutane Syndrome) und Entwicklungsstörungen in Kombination mit Gehirnfehlbildungen (z. B. pontozerebelläre Hypoplasie) haben. Darüber hinaus untersuchen wir in ausgewählten Projekten, wie sich genetische Veränderungen auf die Funktion des vom Krankheitsgen kodierten Proteins auswirken und führen umfangreiche molekularbiologische, biochemische und zellbiologische Untersuchungen an unterschiedlichen Zellsystemen zur Aufklärung des Pathomechanismus durch.

• Holling T, Brylka L, Scholz T, Bierhals T, Herget T, Meinecke P, Schinke T, Oheim R, Kutsche K. (2023) TMCO3, a putative K+:proton antiporter at the Golgi apparatus, is important for longitudinal growth in mice and humans. J Bone Miner Res. 38:1334-1349.
• Harms FL, Dingemans AJM, Hempel M, Pfundt R, Bierhals T, Casar C, Müller C, Niermeijer JF, Fischer J, Jahn A, Hübner C, Majore S, Agolini E, Novelli A, van der Smagt J, Ernst R, van Binsbergen E, Mancini GMS, van Slegtenhorst M, Barakat TS, Wakeling EL, Kamath A, Downie L, Pais L, White SM, de Vries BBA, Kutsche K. (2023) De novo PHF5A variants are associated with craniofacial abnormalities, developmental delay, and hypospadias. Genet Med. 25:100927.
• Holling T, Bhavani GS, von Elsner L, Shah H, Kausthubham N, Bhattacharyya SS, Shukla A, Mortier GR, Schinke T, Danyukova T, Pohl S, Kutsche K, Girisha KM. (2022) A homozygous hypomorphic BNIP1 variant causes an increase in autophagosomes and reduced autophagic flux and results in a spondylo-epiphyseal dysplasia. Hum Mutat 43:625-642.
• von Elsner L, Chai G, Schneeberger PE, Harms FL, Casar C, Qi M, Alawi M, Abdel-Salam GMH, Zaki MS, Arndt F, Yang X, Stanley V, Hempel M, Gleeson JG, Kutsche K. (2022) Biallelic FRA10AC1 variants cause a neurodevelopmental disorder with growth retardation. Brain 145: 1551-1563.
• Schneeberger PE, Nampoothiri S, Holling T, Yesodharan D, Alawi M, Knisely AS, Müller T, Plecko B, Janecke AR, Kutsche K. (2021) Biallelic variants in VPS50 cause a neurodevelopmental disorder with neonatal cholestasis. Brain 144: 3036-3049.
• Schneeberger PE, Kortüm F, Korenke GC, Alawi M, Santer R, Woidy M, Buhas D, Fox S, Juusola J, Alfadhel M, Webb BD, Coci EG, Abou Jamra R, Siekmeyer M, Biskup S, Heller C, Maier EM, Javaher-Haghighi P, Bedeschi MF, Ajmone PF, Iascone M, Peeters H, Ballon K, Jaeken J, Rodríguez Alonso A, Palomares-Bralo M, Santos-Simarro F, Meuwissen MEC, Beysen D, Kooy RF, Houlden H, Murphy D, Doosti M, Karimiani EG, Mojarrad M, Maroofian R, Noskova L, Kmoch S, Honzik T, Cope H, Sanchez-Valle A, Undiagnosed Diseases Network, Gelb BD, Kurth I, Hempel M, Kutsche K (2020) Biallelic MADD variants cause a phenotypic spectrum ranging from developmental delay to a multisystem disorder. Brain 143:2437-2453.
• Bauer CK, Schneeberger PE, Kortüm F, Altmüller J, Santos-Simarro F, Baker L, Keller-Ramey J, White SM, Campeau PM, Gripp KW, Kutsche K (2019) Gain-of-function mutations in KCNN3 encoding the small-conductance Ca(2+)-activated K(+) channel SK3 cause Zimmermann-Laband syndrome. Am J Hum Genet 104: 1139-1157.
• Harms FL, Kloth K, Bley A, Denecke J, Santer R, Lessel D, Hempel M, Kutsche K (2018) Activating mutations in PAK1 encoding p21-activated kinase 1 cause a neurodevelop-mental disorder. Am J Hum Genet 103: 579-591.
• Meyer zum Büschenfelde U, Brandenstein LI, von Elsner L, Flato K, Holling T, Zenker M, Rosenberger G, Kutsche K (2018) RIT1 controls actin dynamics via complex formation with RAC1/CDC42 and PAK1. PLoS Genet 7: e1007370.
• Harms FL, Girisha KM, Hardigan AA, Kortüm F, Shukla A, Alawi M, Dalal A, Brady L, Tarnopolsky M, Bird LM, Ceulemans S, Bebin M, Bowling KM, Hiatt SM, Lose EJ, Primiano M, Chung WK, Juusola J, Akdemir ZC, Bainbridge M, Charng WL, Drummond-Borg M, Eldomery MK, El-Hattab AW, Saleh MAM, Bézieau S, Cogné B, Isidor B, Küry S, Lupski JR, Myers RM, Cooper GM, Kutsche K (2017) Mutations in EBF3 Disturb Transcriptional Profiles and Cause Intellectual Disability, Ataxia, and Facial Dysmorphism. Am J Hum Genet 100: 117-127.
• Kortüm F, Caputo V, Bauer CK, Stella L, Ciolfi A, Alawi M, Bocchinfuso G, Flex E, Paolacci S, Dentici ML, Grammatico P, Korenke GC, Leuzzi V, Mowat D, Nair LDV, Nguyen TTM, Thierry P, White SM, Dallapiccola B, Pizzuti A, Campeau PM, Tartaglia M, Kutsche K (2015) Mutations in KCNH1 and ATP6V1B2 cause Zimmermann-Laband syndrome. Nat Genet 47: 661-667.

Das Noonan-, kardio-fazio-kutane (cardio-facio-cutaneous, CFC) und Costello-Syndrom gehören zu einer Gruppe klinisch ähnlicher Erkrankungen, die durch heterozygote Keimbahnmutationen in für Proteine des RAS-MAPK (mitogen-activated protein kinase)-Signalwegs ko­dieren­den Genen verursacht werden. Sie werden als neuro-kardio-fazio-kutane (neuro-cardio-facio-cutaneous, NCFC) Syndrome oder RASopathien zusammengefasst. In etwa 30% der Patienten mit RASopathie-Phänotyp wird in den bekannten Krankheitsgenen keine pathogene Mutation aufgedeckt. Wir wollen neue Gene für die RASopathien durch Exom-Sequenzierung bei ausgewählten Patienten mit klinisch gut definiertem Phänotyp identifizieren. Die Bestätigung potentieller Kandidatengene und das mit den Mutationen assoziierte klinische Spektrum soll durch eine Mutationsanalyse in einer großen Kohorte erfolgen, die Patienten mit variablen Phänotypen aus dem RASopathie-Spektrum einschließt. Ein weiterer Schwerpunkt unserer Arbeiten ist die Charakterisierung der funktionellen Auswirkungen von Mutationen, die mit RASopathien assoziiert sind. Hier wollen wir bei der Analyse von bereits in Vorarbeiten identifizierten neuen Mutationen in bekannten bzw. neuen Krankheitsgenen/Proteinen, die mit RAS-Signalwegen in Zusammenhang stehen, ein gut etabliertes Methodenspektrum von biochemischen und zellbiologischen Untersuchungen einsetzen und ausbauen. Wir erwarten einen bedeutsamen Erkenntnisgewinn, nicht nur hinsichtlich der genetischen Grundlagen der RASopathien und ihrer pathophysiologischen Ursachen, sondern auch im Hinblick auf die Aufklärung der komplexen Regulation des RAS-MAPK-Signalwegs.

Förderung durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft ( KU 1240/9-2 ) von 2020 bis 2025.

Mit der Hochdurchsatzsequenzierung, zu der whole-exome sequencing (WES) und whole-genome sequencing (WGS) zählen, wurde die Aufdeckung genetischer Ursachen für monogene Erkrankungen revolutioniert. WES und WGS sind höchst sensitiv gegenüber der Detektion von single nucleotide variants (SNVs) und small insertions and/or deletions (indels). Durch Trio-WES wird eine Aufklärungsrate von ~40% erreicht, die durch computergestützte Analysen von copy number variants (CNVs) um 2-10% gesteigert werden kann. WGS hat gegenüber WES entscheidende Vorteile, wie die gleichmäßige Datenqualität über das gesamte Genom hinweg und den Zugang zu bestimmten Varianten. Hierzu gehören Varianten in Promotor- und untranslatierten Regionen von proteinkodierenden Genen, solche in RNA-Genen und nicht-kodierenden Regionen sowie strukturelle Varianten (SVs) wie Inversionen und Translokationen. Mit der Aufdeckung von 4-5 Millionen Varianten pro Genom wächst die Schwierigkeit der systematischen Variantenpriorisierung. Komplementär zu WGS kann RNA sequencing (RNA-seq) eingesetzt werden, wodurch aberrante Transkripte sowie eine differentielle und/oder monoallelische Expression eines Gens aufgedeckt werden können. Aktuelle Studien zeigen, dass RNA-seq ein unverzichtbarer Begleiter von WGS ist, um eine erfolgreiche Priorisierung und Interpretation der Millionen Varianten zu erreichen.

Wir wollen die genetische Ursache in 25 Familien, in denen eine/mehrere Person/en eine monogene Erkrankung und keine durch WES gestellte genetische Diagnose haben, identifizieren und damit zur Aufklärung neuer Krankheitsgene beitragen. Zunächst werden vorhandene Exom-Daten von 42 Betroffenen mittels verschiedener computergestützter Algorithmen auf das Vorliegen von möglichen pathogenen CNVs analysiert. Bei 25 klinisch gut charakterisierten Patienten ohne genetische Diagnose und Eltern wird anschließend WGS durchgeführt. Die Filterung und Priorisierung der Varianten erfolgt stufenweise nach (i) in proteinkodierenden und Spleiß-Regionen lokalisierten SNVs/indels, (ii) CNVs und SVs, die exonische, proteinkodierende und Spleiß-Regionen umfassen, und (iii) de novo vorliegenden nicht-kodierenden Varianten in putativ regulatorischen Regionen. Hierfür werden verschiedene bioinformatische Methoden evaluiert und etabliert. Validierung und Segregation der genetischen Varianten erfolgt durch klassische molekulargenetische Methoden. Mit Hilfe von RNA-seq an RNA aus Fibroblasten der 25 o. g. Patienten sollen fehlgespleißte mRNAs und monoallelisch/differentiell exprimierte Gene aufgedeckt werden. Durch die Integration von WGS- und RNA-seq-Daten sollen potentiell krankheitsrelevante Varianten herausgefiltert werden. Mit dem Auffinden von Kandidatengenen wird international nach weiteren Betroffenen gesucht. Die funktionellen Auswirkungen verschiedener Varianten auf das Genprodukt und assoziierte Signalwege werden durch biochemische und zellbiologische Assays untersucht.

Förderung durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft ( KU 1240/13-1 ) von 2020 bis 2024.

Die Next-generation sequencing-Technologie hat die Entdeckung neuer Krankheitsgene für monogene Krankheiten beschleunigt. Um die Pathogenität genomischer Varianten zu bestätigen und unser Verständnis der Biologie und Pathophysiologie von Krankheiten zu verbessern, kann eine Vielzahl von biochemischen und zellbiologischen Assays an Patient:innen-Zellen und/oder etablierten Zellmodellen durchgeführt werden. Funktionelle Studien sind wichtig, um die Funktion von uncharakterisierten offenen Leserahmen aufzuklären, in denen pathogene Varianten Krankheiten verursachen.

In diesem Projekt werden wir funktionelle Studien zu pathogenen Varianten in drei Genen durchführen. Wir identifizierten die de novo FBXW11-Missense-Variante c.1139C>T/p.(Ser380Phe) bei einem Patienten mit Mikrozephalie, Kleeblattschädel und fazialen Dysmorphien. Sieben pathogene FBXW11-Varianten wurden bei Personen mit unterschiedlichen Phänotypen beschrieben. FBXW11 kodiert ein F-Box-Protein, das als Substratadapter für den SKP, Cullin, F-Box-haltigen Komplex, eine E3-Ubiquitin-Ligase, fungiert, der am proteasomalen Abbau verschiedener Substrate beteiligt ist. Der Effekt von p.(Ser380Phe) und vier publizierten Varianten auf die FBXW11-Substratbindung wird analysiert, indem wir die Menge der Bindungspartner von HA-getaggtem FBXW11-Wildtyp und -Mutanten in einem zellulären System bestimmen. Für Substrate mit verminderter oder verstärkter Bindung an FBXW11-Mutanten werden deren Umsatzrate, die Steady-State- und Ubiquitinierungsmengen bestimmt. Mögliche weitere Experimente konzentrieren sich auf spezifische Signalwege und/oder zelluläre Funktionen, die von bestimmten FBXW11-Varianten beeinflusst werden. Wir identifizierten C20orf204, das ein kaum charakterisiertes Protein kodiert, als neues Krankheitsgen für einen schweren Immundefekt. C20orf204 wird in naiven T-Zellen exprimiert und fungiert als Zytokin oder Zytokininhibitor. Um die biologische Rolle von C20orf204 in T-Zellen zu charakterisieren, werden wir mit Experten zusammenarbeiten. Rekombinantes C20orf204-Protein wird in eukaryotischen Zellen hergestellt und aufgereinigt. Die Funktion von C20orf204 bei der Kontrolle der T-Zell-Homöostase wird untersucht. Wir analysieren, ob C20orf204 über den Interleukin-7-Rezeptor Signalwege aktiviert, ein negativer Regulator von thymischem stromalem Lymphopoietin ist und das Überleben und die Erhaltung naiver T-Zellen beeinflusst. Wir identifizierten biallelische WDHD1-Varianten bei Personen mit mikrozephalem Kleinwuchs. WDHD1 integriert den CMG-Helikase-Komplex und den DNA-Polymerase-α/Primase-Komplex, um die DNA-Replikation zu initiieren. Mittels Patienten-Fibroblasten werden wir die Auswirkungen der WDHD1-Varianten auf den Zellzyklus und die Zellproliferation, die Reaktion auf DNA-Schäden und die DNA-Replikationsmaschinerie untersuchen. Unsere Studien werden dazu beitragen, das Verständnis über biologische Prozesse, die der menschlichen Gesundheit und Krankheit zugrunde liegen, zu verbessern.

Förderung durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft ( KU 1240/16-1 ) von 2022 bis 2025.

Seltene Mendel’sche Krankheiten sind in der Regel monogen und umfassen ~8.000 Erkrankungen. Kongenitale Hirnkrankheiten, wie Mikrozephalie, Fehlbildungen des Kortex, des Hinterhirns und des Corpus Callosum, gehören zu den monogenen Krankheiten. Die Gesamt-Exom-Sequenzierung (GES), hauptsächlich GES von Patienten-Eltern-Trios, hat wesentlich zur Krankheitsgenidentifizierung und dem Verständnis der Beziehung zwischen Genen, Phänotypen und molekularen Mechanismen beigetragen. Die Gesamt-Genom-Sequenzierung (GGS) ist der logische nächste Schritt für die Aufdeckung von nicht durch GES gefundenen krankheitsassoziierten Varianten und neuen Krankheitsgenen; dazu gehören Varianten in nicht-kodierenden Regionen von proteinkodierenden Genen, solche in RNA-Genen und strukturelle Varianten. Die Transkriptomsequenzierung (TS) kann als begleitende Methode nützlich sein, um aberrante Expressionslevel, aberrantes Spleißen und monoallelische Expression aufzudecken. Hierdurch können die durch GGS aufgedeckten Kandidatengene priorisiert werden. Für die Untersuchung des Einflusses einer potenziell pathogenen Variante ist der zelluläre Kontext, in dem ein Krankheitsgen exprimiert wird, wichtig. Die entsprechenden Gewebeproben sind aber in der Mehrheit der Fälle nicht verfügbar. Humane pluripotente Stammzellen (hiPSCs), die von Patientenzellen generiert und in vitro in den gewünschten Zelltyp differenziert werden, dienen als Modellsystem für die TS und die Untersuchung des zellulären Phänotyps.

In diesem Projekt wollen wir die genetische Ursache bei 25 GES-negativen Patienten mit kongenitaler Hirnkrankheit aufdecken: 7 Patienten haben Anomalien der Kommissuren und 13 des Hinterhirns, 3 zeigen Fehlbildungen der kortikalen Entwicklung, alle entweder mit oder ohne Mikrozephalie, und 2 haben Mikrozephalie mit intrauteriner Wachstumsretardierung. Existierende Trio-GES-Daten werden zunächst mit einer aktualisierten bioinformatischen Pipeline reanalysiert, um potenziell pathogene Varianten in einem Krankheits- oder Kandidatengen in bis zu 20% der 25 Patienten zu finden. Im nächsten Schritt wird bei 20 genetisch ungelösten Patienten eine Trio-GGS durchgeführt, um potenziell pathogene Varianten in einem Gen oder nicht-kodierender Region aufzudecken. Maximal 5 Patienten mit einer Variante in nicht-kodierender Region oder ohne genetische Variante nach GGS sowie deren gesunde Eltern werden ausgewählt, um aus ihren primären Urinzellen hiPSCs herzustellen, diese in humane induzierte neurale Stammzellen (hiNSCs) zu differenzieren und TS an aus hiNSCs isolierter RNA durchzuführen. Die Integration von GGS- und TS-Daten soll die Aufdeckung oder Bestätigung der genetischen Ursache bei den Patienten unterstützen. hiNSCs von einem bzw. maximal zwei Patienten-Eltern-Trio(s), die genetisch geklärt wurden, sollen in humane kortikale Neuronen differenziert und hinsichtlich morphologischer Auffälligkeiten untersucht werden, um Einblicke in die Pathophysiologie zu erlangen.

Förderung durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft ( KU 1240/17-1 ) von 2022 bis 2025.